非洲豬瘟熒光定量PCR儀標準化操作流程

　　一、實驗前準備

　　1.設備預熱：

　　開啟非洲豬瘟熒光定量pcr儀，選擇預運行程序進行系統預熱，建議預熱時間≥30分鐘。檢查各溫控模塊性能，確保溫度波動≤±0.5℃（95℃測試點）。

　　2.樣本處理：

　　核酸提取：采用商品化核酸提取試劑盒，按說明書操作獲取DNA模板。提取后的核酸需在2小時內完成檢測，-20℃保存不得超過7日。

　　試劑準備：配制反應體系（20μL體系）：

　　（1）2×熒光PCR反應液 10μL

　　（2）引物探針混合液 1μL

　　（3）酶混合物 0.5μL

　　（4）模板DNA 5μL（濃度50-100ng/μL）

　　（5）滅菌ddH?O 3.5μL

　　配置好的反應體系于冰上保存備用，避免反復凍融。

　　二、實驗操作規程

　　1.上機設置

　　選擇ASFV專用檢測程序：

　　（1）預變性：95℃ 30s

　　（2）循環擴增（40 cycles）：

　　①變性：95℃ 5s

　　②退火/延伸：60℃ 30s

　　③熒光采集：FAM通道（探針檢測）

　　2.樣本裝載

　　將配置好的反應管裝入加熱模塊，確認：

　　（1）管蓋密封完好

　　（2）試管無氣泡殘留

　　（3）樣本編號與軟件對應

　　設置陰性對照（N/C）、陽性對照（P/C）和標準品，建議每板設置3個N/C。

　　3.儀器運行：啟動PCR程序，實時監控擴增曲線。正常狀態下，陰性對照應無S型擴增，陽性對照CT值應在18-25之間。

　　三、結果分析與報告

　　1.數據分析

　　CT值判定標準：

　　（1）CT≤30且呈現典型S型曲線為陽性

　　（2）CT＞35或無擴增曲線為陰性

　　（3）30＜CT≤35需重復驗證

　　FAM通道Ct值≤閾值（可參照試劑盒要求）判定為ASFV核酸陽性。

　　2.報告生成

　　報告內容應包含：

　　（1）樣本編號及來源；

　　（2）CT值及擴增曲線圖；

　　（3）陽性/陰性判定結果；

　　（4）檢測及復核人員簽名；

　　（5）檢測日期及實驗室信息；

　　3.廢棄處理：實驗結束后，生物危害廢棄物需按規程處理，反應管置于專用廢料桶中。
 

　　四、非洲豬瘟熒光定量pcr儀注意事項

　　1.操作全程必須穿戴防護服和手套；

　　2.每批次實驗需同時設立陰、陽性對照；

　　3.儀器表面每日使用75%乙醇消毒；

　　4.建議每月使用標準物質進行儀器校準；

　　5.當檢測結果異常時，必須進行復檢確認。

　　本操作流程嚴格遵循GB/T 40947-2021《非洲豬瘟診斷技術》國家標準，規范化的操作可有效預防交叉污染，確保檢測結果的準確性和重復性。實驗室需建立完整的質量控制體系，定期對操作人員進行專業培訓，為非洲豬瘟防控工作提供科學依據。